Forskere har i nesten to tiår visst at enkelte varianter av tarmbakterien Bacteroides fragilis kan produsere et giftstoff som skader tykktarmen og bidrar til svulstdannelse. Nå har et team ledet av forskere ved Johns Hopkins Kimmel Cancer Center identifisert det første festepunktet giftstoffet bruker når det angriper tarmcellene.

Proteinet heter claudin-4. Oppdagelsen viser hvordan giftstoffet, som kalles B. fragilis-toxin eller BFT, først binder seg til cellene før det bryter ned en annen viktig del av tarmens beskyttende barriere. Forskerne har også utviklet en løselig proteinvariant som fungerer som en molekylær lokkedue. I forsøk på mus bandt BFT seg til lokkeduen i stedet for til cellene, og vevet ble beskyttet mot giftstoffets skadelige virkninger.

En bakterie som finnes hos friske mennesker

Bacteroides fragilis finnes i tarmen hos opptil 20 prosent av friske mennesker. Tilstedeværelsen av bakterien betyr ikke automatisk at en person vil utvikle kreft. Enkelte stammer produserer imidlertid BFT, et kraftig giftstoff som kan forstyrre tykktarmens beskyttende slimhinne, utløse betennelse og fremme svulstvekst.

I en studie publisert i Nature Medicine i 2009 viste Cynthia Sears og kollegene hennes at giftstoffet kunne fremme utviklingen av svulster i tykktarmen. Arbeidet bidro til å etablere en sammenheng mellom giftstoffproduserende tarmbakterier, langvarig betennelse og tykk- og endetarmskreft.

Tidligere forsøk hadde også vist at BFT skader proteinet E-cadherin. Dette proteinet bidrar til å holde naboceller sammen og opprettholde den beskyttende barrieren i tykktarmen. Når E-cadherin brytes ned, blir barrieren svekket, og skadelige stoffer og bakterier kan lettere påvirke vevet rundt.

Forskerne visste likevel ikke hvordan BFT kom i kontakt med E-cadherin. Giftstoffet så ikke ut til å feste seg direkte til E-cadherin, noe som tydet på at et annet molekyl måtte hjelpe BFT med å nå målet sitt.

CRISPR avslørte festepunktet

For å finne det manglende leddet brukte forskerne CRISPR, en genteknologisk metode som gjør det mulig å slå av gener enkeltvis og undersøke hvilken funksjon de har.

Maxwell White, som er M.D./Ph.D.-student i Sears’ laboratorium, ledet en genomomfattende CRISPR-screening i samarbeid med Matthew Waldors laboratorium ved Harvard Medical School. Forskerne slo systematisk av gener i epitelceller fra tykktarmen – cellene som danner det indre cellelaget – for å se hvilke gener som var nødvendige for at BFT skulle feste seg og gjøre skade.

Én kandidat skilte seg klart ut. Det var genet som lager claudin-4, et protein som hjelper naboceller med å danne såkalte tight junctions. Dette er tette forbindelser mellom cellene som begrenser bevegelsen av stoffer mellom dem og bidrar til å opprettholde tarmbarrieren.

Da forskerne slo av genet for claudin-4, kunne BFT ikke lenger binde seg til tykktarmcellene. Uten denne første bindingen klarte giftstoffet heller ikke å angripe E-cadherin.

«It took a while to get the assay working and validate the approach, but once we were able to do the screen, claudin-4 was a clear, resounding top hit. That was an exciting moment.»

Det sier White i forbindelse med funnet.

Resultatene viser dermed at claudin-4 fungerer som en reseptor for bakteriegiftstoffet. BFT må først feste seg til dette proteinet før det kan utføre den skadelige aktiviteten sin.

En uvanlig strategi for et bakteriegiftstoff

Forskerne hadde ikke ventet at claudin-4 skulle være reseptoren. Sears og kollegene trodde snarere at BFT ville samhandle med et protein som er involvert i cellesignalering, for eksempel en G-proteinkoblet reseptor. Slike reseptorer fungerer som kommunikasjonssvitsjer som lar celler reagere på signaler fra omgivelsene.

Claudin-4 har en annen hovedoppgave. Proteinet bidrar først og fremst til de fysiske forbindelsene mellom naboceller og til å opprettholde vevets barriere.

Oppdagelsen viser også en uvanlig måte et bakteriegiftstoff kan virke på. BFT tilhører enzymklassen proteaser, som kan klippe over andre proteiner. De fleste proteaser angriper målet sitt direkte, mens BFT ser ut til å trenge en separat reseptor for å komme frem til og skade E-cadherin.

Da forskerne gikk gjennom tidligere forskning, fant de ingen andre kjente giftstoffer som bruker den samme mekanismen.

For å bekrefte at BFT faktisk binder seg til claudin-4, samarbeidet Johns Hopkins-forskerne med strukturbiologene F. Xavier Gomis-Rüth og Ulrich Eckhard ved Molecular Biology Institute of Barcelona. Ved hjelp av metoder som måler hvordan molekyler samhandler, viste White og Barcelona-teamet at BFT og claudin-4 danner et tett bundet kompleks i laboratorieforsøk. Ett giftstoffmolekyl bandt seg til ett reseptormolekyl.

Utviklet en molekylær lokkedue

Da forskerne hadde identifisert reseptoren, fikk de også en idé om hvordan giftstoffet kunne blokkeres. Hvis BFT trenger claudin-4 for å feste seg til tarmcellene, kunne kanskje en erstatning lokke giftstoffet bort fra det egentlige målet.

Teamet utviklet derfor en molekylær lokkedue: et løselig protein med sekvenser fra claudin-4. Proteinet var utformet for å tiltrekke seg BFT uten at giftstoffet kunne angripe tarmens beskyttende barriere.

Forskerne samarbeidet deretter med Min Dongs laboratorium ved Harvard Medical School, blant andre Kang Wang og kolleger, for å undersøke metoden i mus. Forsøkene gjorde det mulig å studere hvordan giftstoffet oppførte seg i en levende tarm, der samspillet mellom molekyler er mer komplekst enn i laboratoriet.

Resultatene var lovende. I stedet for å binde seg til claudin-4 på tykktarmcellene festet BFT seg til lokkedueproteinene. Ved å fange opp giftstoffet beskyttet lokkeduen musene mot skader utløst av BFT.

Funnene tyder på at det kan være mulig å stanse det første trinnet i giftstoffets angrep, i stedet for å forsøke å reparere skaden etterpå.

«This approach could be iterated upon with small molecules or other biologics that have better pharmacological properties,»

sier White. Teamet undersøker nå hvilke molekylære metoder som kan være best egnet til å blokkere giftstoffet.

Små molekyler er forbindelser som i noen tilfeller kan utvikles til legemidler. Biologiske legemidler er behandlinger som er laget av eller involverer biologisk materiale, som proteiner. Fremtidige varianter av lokkeduestrategien kan ifølge forskerne utformes slik at de virker mer effektivt i kroppen eller blir enklere å administrere.

Ikke dokumentert forebygging av kreft hos mennesker

Selv om funnet gir forskerne et lovende nytt mål, står flere spørsmål ubesvart. Det er fastslått at BFT binder seg til claudin-4, og at blokkering av denne kontakten kan beskytte mus mot skader utløst av giftstoffet. Forskerne har imidlertid ennå ikke kartlagt den nøyaktige tredimensjonale strukturen som viser hvordan de to molekylene passer sammen.

Selv avanserte kunstig intelligens-verktøy, blant annet AlphaFold, har ikke klart å løse samspillet fullt ut. En mer presis forståelse av strukturen kan gjøre det mulig å utvikle mer effektive forbindelser som hindrer giftstoffet i å binde seg.

Det trengs også flere forsøk for å avgjøre om lokkeduestrategien er trygg og effektiv mot giftstoffrelatert sykdom hos mennesker. Museforsøkene viste beskyttelse mot vevsskade, men dokumenterte ikke at metoden forebygger tykk- og endetarmskreft.

Oppdagelsen løser likevel et spørsmål som har stått ubesvart siden sammenhengen mellom BFT og dannelsen av svulster i tykktarmen ble etablert i 2009. Ved å identifisere giftstoffets tidligere ukjente festepunkt har forskerne funnet en mulig måte å avbryte den skadelige prosessen før den starter.

Forskerne mener funnet på sikt kan bidra til nye metoder for å oppdage eller behandle tilstander som er knyttet til bakteriegiftstoffer, blant annet tykk- og endetarmskreft, diaré og infeksjoner i blodet.

Studien ble ledet av forskere ved Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, Bloomberg~Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy og Johns Hopkins University School of Medicine. Den ble delvis støttet av National Institutes of Health. Andre bidragsytere var Jason Chen, Shaoguang Wu, Abby L. Geis og Jessica Queen ved Johns Hopkins, samt Hailong Zhang, Karthik Hullahalli og Jie Zhang ved Harvard Medical School.

Finansieringen kom fra Bloomberg~Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Janssen Research and Development, Cancer Research UK, National Institutes of Health – med tilskuddene R01 AI042347, R01 NS080833, R01 NS117626, R01 AI170835 og R01 AI189789 – samt Howard Hughes Medical Institute.